La película comienza cuando un grupo de científicos descubre un objeto de color azul, rojo y blanco.
Después, la historia se traspasa a 1942 cuando el oficial nazi Johann Schmidt (Hugo Weaving) y sus hombres invaden la aldea de Tønsberg en Noruega, para robar un extraño artefacto de forma cúbica que supuestamente contiene poderes especiales. Entre tanto, en Nueva York, el joven Steve Rogers (Chris Evans) es rechazado por el ejército estadounidense como recluta para la Segunda Guerra Mundial, debido a su condición física y estado de salud. Luego de asistir a una exposición sobre tecnologías futuristas con su amigo Bucky Barnes (Sebastian Stan), Rogers intenta nuevamente alistarse.
El Dr. Abraham Erskine (Stanley Tucci) ayuda al muchacho a entrar al ejército después de escuchar la conversación que Rogers sostiene con Barnes sobre su deseo de apoyar en la guerra. El joven es finalmente reclutado, pero como parte de un experimento para crear a un «supersoldado» (el cual está bajo la supervisión de Erskine, del coronel Chester Phillips (Tommy Lee Jones) y de la agente inglesa Peggy Carter) (Hayley Atwell). Phillips se muestra inconforme con la elección de Erskine sobre Rogers, alegando que él no es el indicado para el procedimiento, aunque declina su posición ante ello después de ver a Roger actuar de manera heroica al sacrificarse para proteger a un pelotón de reclutas de una granada. La noche anterior al tratamiento experimental, Erskine le menciona a Rogers que otro soldado —que resulta ser Schmidt— se convirtió en una versión imperfecta del supersoldado por un error en el procedimiento y a causa de ello sufrió de efectos secundarios.
De vuelta en Europa, Schmidt y el Dr. Arnim Zola (Toby Jones) logran manipular la energía que el artefacto emana de manera misteriosa, con el fin de utilizar dicho poder en las nuevas armas que Zola había desarrollado. Schmidt, una vez que localiza la ubicación de Erskine, contrata a un asesino para que lo mate. En Estados Unidos, Erskine somete a Rogers al tratamiento del supersoldado, inyectándole un suero especial junto una dosis de radiación. Una vez que Rogers sale de una cápsula de experimentación (con una altura y masa muscular más notoria) uno de los asistentes asesina a Erskin, pues era el asesino que Schmidt había contratado (Heinz Kruger) (Richard Armitage). Rogers persigue y captura a Kruger, pero el asesino se suicida con una cápsula de cianuro antes de que pudiera ser interrogado.
Con Erskine muerto y la fórmula para el suero del supersoldado perdida, el senador Brandt le indica a Rogers que recorra el país con un colorido traje, bajo el pseudónimo de «Capitán América», con el fin de recaudar fondos para la guerra en vez de permitir que los científicos lo analizaran para redescubrir la fórmula de Erskine. En 1943, mientras se encontraba de gira en Italia para un pelotón en servicio activo, Rogers averigua que la unidad en la que se estaba Barnes se perdió después de librar una batalla contra las fuerzas de Schmidt. Negando la muerte de Barnes, Rogers junto con Carter y Howard Stark (Dominic Cooper) lo ayudan gracias a un avión, logrando sobrevolar las líneas enemigas y dejándole en una misión de rescate en solitario. El Capitán se infiltra en la fortaleza de la organización controlada por Schmidt (Hydra), logrando liberar a Barnes junto con otros soldados capturados. Rogers se enfrenta a Schmidt, quien revela que su rostro no es más que una máscara, la cual cubre un rostro semejante a un cráneo rojo (lo que justifica su sobrenombre, «Red Skull»). Schmidt escapa y Rogers regresa a la base militar junto con los demás soldados.
Rogers recluta a Barnes, Timothy "Dum Dum" Dugan (Neal McDonough), Gabe Jones (Derek Luke), Jim Morita (Kenneth Choi), James Montgomery Falsworth (J.J. Feild) y a Jacques Dernier (Bruno Ricci) para atacar las demás centrales de Hydra. Stark dota a Rogers con un traje y equipo avanzado, en especial con un escudo circular hecho de vibranium (un metal poco común y casi indestructible). Rogers junto con su equipo logran sabotear varios de los planes de Hydra. El escuadrón intercepta un tren en el que va Zola. Éste es capturado, pero como concecuencia Barnes cae por un precipicio desde el tren, causando aparentemente su muerte. Usando la información extraída de Zola, el último cuartel de Hydra por fin se conoce y Rogers idea un plan para frustrar de una vez por todas los planes de Schmidt, que consisten en el uso de un arma de destrucción masiva para erradicar diversas ciudades estadounidenses. El Capitán América logra escabullirse en un avión de Red Skull y lo embosca en el acto. Durante la pelea que ambos entablan, el contenedor del cubo cósmico —el extraño artefacto que encuentran al inicio de la película— resulta dañado. Schmidt coge el directamente el aparato, desintegrándose en medio de una brillante luz. El cubo cae al suelo, pero debido a sus características místicas, quema todo lo que toca y cae en el océano. En vista de que no puede aterrizar el avión sin detonar ninguna de las armas, Rogers se hace estrellar junto con el avión en una zona recóndita del Ártico. Stark recupera el extraño artefacto del suelo submarino, pero es incapaz de localizar el avión de Rogers.
De repente, el Capitán despierta en un cuarto de hospital con apariencia de los años 40. Sin embargo, después de escuchar una radiodifusión anacrónica, deduce que algo no anda bien; una vez fuera del lugar donde se encontraba, se sorprende al ver el mundo actual, donde Nick Fury (Samuel L. Jackson) le explica que ha estado «dormido» por más de 70 años.
En una escena posterior a los créditos, Fury se acerca a Rogers y le propone ayudarle en una misión de escala mundial.

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